適用于靈長(zhǎng)類(lèi) ES/iPS 細(xì)胞的玻璃化凍存液

StemCell Keep

StemCell Keep 在保持高玻璃化能的同時(shí)，抑制了細(xì)胞毒性，是一款適用于靈長(zhǎng)類(lèi) ES/iPS 細(xì)胞的玻璃化凍存液。

※本產(chǎn)品僅供研究使用，研究以外不可使用

◆關(guān)于 DAP213 等含有 DMSO 的保存液的問(wèn)題

DMSO 作為普通細(xì)胞冷凍保護(hù)成分常被添加到保存液中，但同時(shí)也是對(duì)人體有害的成分，且極易被皮膚吸收。除具有細(xì)胞毒性外，如同下列論文所述，是影響細(xì)胞分化的因子之一。因此， DMSO 用于保存并不是十分理想的。現(xiàn)有的玻璃化凍存液 DAP213 中除了高濃度DMSO之外，還被指出含致癌性物質(zhì)乙酰胺。除此之外，由于其溶質(zhì)濃度高，還被指出會(huì)因?yàn)闈B透壓引起毒性。

另外，使用 DAP213 時(shí)，若不能在 10~30 s 內(nèi)完成保存，那么解凍后的存活率便會(huì)大幅下降，而 StemCell Keep 只需在是在約 1 min 內(nèi)完成保存，且操作難度低，也不需要嫻熟的技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

?使用 DMSO 將人骨髓白血病細(xì)胞株 HL-60 分化為粒細(xì)胞。

Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

?使用DMSO將小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。

Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

?使用含有 DMSD 的保存液凍存人ES細(xì)胞發(fā)現(xiàn)未分化標(biāo)記 Oct-4 的表達(dá)降低。

Katkov, I. I., et al., Cyobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆玻璃化凍存法是什么

玻璃化凍存法是一種將細(xì)胞直接迅速浸沒(méi)到液氮中防止水結(jié)晶，并在非晶質(zhì)的玻璃狀態(tài)下進(jìn)行冷凍的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于水的體積不會(huì)膨脹，因此給細(xì)胞帶來(lái)的損害較少。若采用一般冷凍法，靈長(zhǎng)類(lèi)ES/iPS細(xì)胞在解凍后的存活率較低，所以我們推薦使用玻璃化凍存法。然而，由于玻璃化需要較高的溶質(zhì)濃度，存在細(xì)胞毒性容易因溶質(zhì)變高的問(wèn)題，因此低毒性凍存液的誕生備受期待。

◆關(guān)于靈長(zhǎng)類(lèi)ES/iPS細(xì)胞保存和玻璃化凍存法

◆特點(diǎn)

●  不含影響分化的DMSO以及動(dòng)物蛋白成分

●  通過(guò)玻璃化法保存可在保持細(xì)胞集落狀態(tài)下進(jìn)行凍存

●  可在維持干細(xì)胞多向分化能的狀態(tài)下進(jìn)行（未分化狀態(tài)）凍存

●  在高安全性新型冷凍保護(hù)物質(zhì)（zhuan利申請(qǐng)中）的高度細(xì)胞保護(hù)作用以及玻璃狀態(tài)維持作用下，能夠更高效地凍存●  ES/iPS細(xì)胞細(xì)胞集落

●  按照使用方案使用的情況下，可保存100管

●  經(jīng)無(wú)菌測(cè)試確認(rèn)無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體污染

●  本產(chǎn)品可在4°C下長(zhǎng)期穩(wěn)定保存（有效期2年）

※使用臺(tái)盼藍(lán)處理StemCell Keep保存的細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)務(wù)必清洗細(xì)胞。

◆案例比較

人iPS細(xì)胞凍存

使用現(xiàn)有玻璃化冷凍液（DAP213）以及本產(chǎn)品凍存人iPS細(xì)胞一周，圖為解凍第二天的細(xì)胞集落形成率以及4天后的細(xì)胞數(shù)量（復(fù)蘇率）與非冷凍組形成的百分比。結(jié)果表明，使用本產(chǎn)品冷凍的組的保護(hù)效果明顯更好。

◆應(yīng)用實(shí)例1

解凍使用本產(chǎn)品冷凍的人iPS細(xì)胞后的未分化標(biāo)記表達(dá)

無(wú)論是（A）堿性磷酸酶（AP）、（B）OCT-4、（C）SSEA-4、（D）TRA-1-60都呈陽(yáng)性，由此可知細(xì)胞維持了未分化狀態(tài)。

解凍使用本產(chǎn)品冷凍的人iPS細(xì)胞后的多能性評(píng)估

將解凍后的iPS細(xì)胞在未經(jīng)處理的板上培養(yǎng)，制備胚狀體后，在普通的培養(yǎng)板上培養(yǎng)一周。檢測(cè)出了三胚層來(lái)源的蛋白。

◆應(yīng)用實(shí)例2

使用本產(chǎn)品保存京都大學(xué)來(lái)源的人ES細(xì)胞（KhES1, KhES3）后進(jìn)行培養(yǎng)，分析其各種生物標(biāo)記物和表型。

無(wú)論是在SNL飼養(yǎng)細(xì)胞上（A、B）還是在涂布了Matrigel的板上（C、D）進(jìn)行培養(yǎng)，ES細(xì)胞都有成長(zhǎng)。

培養(yǎng)5日后，確認(rèn)到AP（堿性磷酸酶）的表達(dá)。

將hES1細(xì)胞播種至SNL飼養(yǎng)細(xì)胞中分別培養(yǎng)3、4、5、6天后進(jìn)行AP染色，測(cè)量細(xì)胞集落數(shù)。使用本產(chǎn)品保存的細(xì)胞第3天起形成細(xì)胞集落，直至第6天細(xì)胞集落逐漸變大。使用DAP213保存的細(xì)胞在第2天仍然很少，雖然第3天的細(xì)胞集落數(shù)與使用本產(chǎn)品保存的細(xì)胞的細(xì)胞集落數(shù)相同，但本產(chǎn)品的細(xì)胞集落更大。

將使用本產(chǎn)品冷凍的ES細(xì)胞解凍后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析干細(xì)胞標(biāo)記TRA-1-60的表達(dá)。

使用本產(chǎn)品保存的細(xì)胞與DAP213的Nanog表達(dá)水平幾乎相同。

圖中紫色部分為Nanog陽(yáng)性細(xì)胞，綠色部分為對(duì)照細(xì)胞。

本產(chǎn)品保存量的97.6%，DAP213保存量的96.2%為陽(yáng)性。

確認(rèn)了使用本產(chǎn)品保存的細(xì)胞的細(xì)胞核類(lèi)型（染色體類(lèi)型）是否有變化。

通過(guò)RT-PCR分析各mRNA表達(dá)量時(shí)采用⊿⊿Ct法。結(jié)果顯示，當(dāng)SOX2設(shè)置為1時(shí)，除了Nanog以外，本產(chǎn)品與DAP213在顯示hEs細(xì)胞的未分化能的轉(zhuǎn)錄因子和粘附因子的表達(dá)率相同。

◆應(yīng)用實(shí)例3

人iPS細(xì)胞凍融過(guò)程中StemCell Keep和DAP213的對(duì)比研究（數(shù)據(jù)提供：山梨大學(xué)）

冷凍人iPS細(xì)胞時(shí)，建議使用DAP213的簡(jiǎn)易玻璃化法。

但是這個(gè)方法有著以下的問(wèn)題：

●  DAP213中含有的DMSO會(huì)抑制Oct3/4的表達(dá)。

●  乙酰胺具有致癌性

●  DAP213可作為冷凍胚時(shí)的少量冷凍劑使用，但不適用于大容量的細(xì)胞保存。

●  添加DAP213后必須在15 s內(nèi)浸沒(méi)到液氮中，需要嫻熟的技術(shù)。

關(guān)于人iPS細(xì)胞（201B7株，理研BRC）1，在添加StemCell Keep以及DAP213后，分別在15、45、90 s后浸沒(méi)到液氮中，并保存6天。解凍后，再培養(yǎng)6天，在此期間測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞集落密度、細(xì)胞集落大小、細(xì)胞集落面積率。

細(xì)胞集落密度

使用StemCell Keep冷凍的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落密度與添加DAP213 15 s后進(jìn)行冷凍處理的結(jié)果相同。使用DAP213冷凍的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落形成明顯受浸沒(méi)前的時(shí)間長(zhǎng)短影響，但使用StemCell Keep的細(xì)胞在解凍后的細(xì)胞集落形成幾乎不受影響（圖1、2）。

細(xì)胞集落大小

圖3、4為細(xì)胞集落大小。使用DAP213冷凍時(shí)的細(xì)胞集落比使用StemCell Keep冷凍時(shí)的細(xì)胞集落要小一些。高粘性的StemCell Keep抑制了移液時(shí)引起的水勢(shì)，結(jié)果表明，StemCell Keep的細(xì)胞集落與DAP213相比更穩(wěn)定。

細(xì)胞集落面積率

由于hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落為單層的均一結(jié)構(gòu)，因此細(xì)胞集落面積大小可直接反映細(xì)胞數(shù)。使用StemCell Keep冷凍的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落占有面積率與添加DAP213 15 s后進(jìn)行冷凍處理的結(jié)果相同。（圖5、6）。其中，即使在添加StemCell Keep45 s以及90 s后進(jìn)行冷凍處理也幾乎沒(méi)有偏差，解凍后可穩(wěn)定地恢復(fù)。

由于使用DAP213時(shí)，從添加到冷凍處理之間的時(shí)限很短，因此需要操作者嫻熟的技術(shù)。但是，使用StemCell Keep的話這些問(wèn)題都能迎刃而解。因此，本次對(duì)比研究中，45 s的冷凍確保了充足的時(shí)間，并且證實(shí)了hiPS細(xì)胞解凍后可以充分恢復(fù)。另外，即使操作花費(fèi)了90 s，穩(wěn)定性雖然會(huì)下降但也可以充分恢復(fù)，可以盡可能地回避操作過(guò)程中發(fā)生始料不及的事故的風(fēng)險(xiǎn)。

但StemCell Keep也有著試劑粘性過(guò)高，難以提取以及混合等問(wèn)題。在混合時(shí)，可以多花些時(shí)間，務(wù)必仔細(xì)徹di地混合5次左右。

 ※使用DAP213時(shí)，hiPS細(xì)胞的存活率約為20%。

參考文獻(xiàn)

1.    Takahashi, K., et al., Cell, 131 (5), 861～872 (2007).

圖1：hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落的密度

圖為每平方厘米左右的細(xì)胞集落數(shù)。

圖2：解凍后第6天的細(xì)胞集落密度（相對(duì)值）

圖為解凍后第6天hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落密度的相對(duì)值。顯示了添加DAP213 15 s后進(jìn)行冷凍處理的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞集落密度為1時(shí)的各細(xì)胞集落密度。

圖3：hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落的大小

圖為培養(yǎng)中形成的細(xì)胞集落大小。

圖4：解凍后第6天的細(xì)胞集落大?。ㄏ鄬?duì)值）

圖為解凍后第6天hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落大小的相對(duì)值。設(shè)添加DAP213 15 s后進(jìn)行冷凍處理的hiPS細(xì)胞的大小為1作為相對(duì)值。

圖5：hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落的面積占有率

圖為細(xì)胞集落面積相對(duì)于培養(yǎng)面積的比例。

圖6：解凍后第6天的細(xì)胞集落面積（相對(duì)值）

圖為解凍后第6天hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落面積的相對(duì)值。設(shè)添加DAP21315 s后進(jìn)行冷凍處理的hiPS細(xì)胞的面積為1作為相對(duì)值。

圖7：培養(yǎng)第6天的培養(yǎng)狀態(tài)

圖為培養(yǎng)第6天的hiPS細(xì)胞細(xì)胞集落的情況（40倍）。

◆操作步驟視頻

◆細(xì)胞解凍步驟視頻

◆操作方法概要

※請(qǐng)事先對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行初步檢測(cè)。

※為獲得高存活率，當(dāng)細(xì)胞懸浮于保存液后，需要立刻將vial浸沒(méi)到液氮中。請(qǐng)?zhí)崆白龊贸浞譁?zhǔn)備再開(kāi)始操作。另

※外，解凍時(shí)，請(qǐng)將預(yù)先將加熱的培養(yǎng)基添加到vial中，迅速溶解更能提高細(xì)胞存活率。

冷凍

1.    在生物安全柜上準(zhǔn)備好液氮。

2.    使用剝離液（0.25%yi蛋白酶 / 1 mg/mL膠原酶IV / PBS溶液）使靈長(zhǎng)類(lèi)ES/iPS細(xì)胞以細(xì)胞集落的形態(tài)剝離。

3.    離心2.中回收的細(xì)胞，去除培養(yǎng)基。若要冷凍多個(gè)時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆袄鋮s，逐個(gè)進(jìn)行以下操作。

4.    添加200 μL本產(chǎn)品，仔細(xì)移液，蓋上蓋子后盡快（約1 min內(nèi)）將vial整個(gè)浸沒(méi)在液氮中。

5.    儲(chǔ)存在液氮罐或-130°C的深冷柜中。

※當(dāng)在60 mm的培養(yǎng)皿中合流時(shí)，則可冷凍1~5 vial左右。

※液體呈透明狀表明玻璃化良好。

右：正常玻璃化的案例

左：出現(xiàn)重結(jié)晶與渾濁的案例

解凍

1.    準(zhǔn)備加熱至37°C的培養(yǎng)基，以及相應(yīng)數(shù)量的加入了9 mL培養(yǎng)基的離心管。

2.    將使用本產(chǎn)品冷凍的細(xì)胞的凍存管放入杜瓦瓶等盛有液氮的容器中移至生物安全柜。

3.    將取出的凍存管的蓋子打開(kāi)，迅速加入1 mL提前加熱的培養(yǎng)基，移液并溶解。

4.    將3.中的全部溶液轉(zhuǎn)移到1.中準(zhǔn)備的加入了9 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心并清洗。

5.    播種至飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。

※解凍時(shí)請(qǐng)逐個(gè)解凍。

◆提供試用裝！

本產(chǎn)品提供小包裝試用裝。有意者請(qǐng)?jiān)趯?zhuān)用申請(qǐng)表中填寫(xiě)必要信息，提交給當(dāng)?shù)亟?jīng)銷(xiāo)商。